PrimerFinder

複数のDNA配列の中の1カ所の指定部分から、3'末端の指定長が配列全体に対してユニークであるようなprimer候補を抽出します。PCR primerのデザインはもちろん、ゲノムを鋳型としてシーケンス反応を行うときに必要とされる特異性の高いprimerのデザインに有用です。指定したTm値を超えるような配列を、各種のチェック項目の結果と併せて表示します。2つのprimer配列を入力して、primer dimerが形成されうるかをチェックすることもできます。

はじめに

PCRを成功させるためには特異的なPCR primerが必要です。また微生物ゲノムを直接(PCR増幅やクローニングなどを経ずに)鋳型にして塩基配列を決定することができますが、この際には特にprimerの特異性が重要になります。PrimerFinderは、PCRの反応溶液中に入っている全ての既知DNA配列に対して、その3'端が一定の長さ以上にわたってユニークであるようなprimerのデザインを支援します。ここでは既知配列のセットをテンプレーツと呼びます。

PrimerFinderは、最初にテンプレーツ中の1部分(例えば指定した4つの配列の3つ目の配列の位置150,000から150,100)について、ユニークなN base (例えば10 base)を探します(つまりこのN baseは、テンプレーツ中の他のどこにも存在しないことになります。なお我々がメインに扱っているバクテリアのゲノムにはユニークな9 baseは存在しないことが分かっています。参考まで)。

そのような配列が見つかった場合、指定したTm値に達するまで、primer配列を5'側に向かって伸ばしていきます。この際、最初に見つけたユニークなN baseは常にprimerの3'端になります。

このprimer候補に対して4つの項目についてチェックを行います。これらは、

• テンプレーツに対してblastnをかけたときの2ndヒットが、primerの長さに対して一定の割合以上にわたってヒットしていないか？
• GC含量が指定の範囲内に収まっているか？
• primerの3'端が回文になっていないか？
• primerの配列内に、GCあるいはATが連続する部分がないか？

についてのチェックです。チェックの結果はOKならば1が、NGならば0が表示されます。

実行例 1

実行例を挙げます(下図)。「select file(s)」ボタンを押して4つのDNAファイル(テンプレーツ)を選択します。3番染色体(ファイル名Bcep_AMMD_03.seq)の、位置150,000から150,100の正方向(向き1)について少なくとも末端11 baseがユニークであるようなprimerの配列候補を抽出します。Tm値は60℃以上、blastnで解析したときの2ndヒットがprimer全長の60%未満、GC含量は50-60%、primerの3'末端は5塩基未満が回文、GCあるいはATの連続は6塩基未満、と設定します。

上のテキストフィールドには、選択されたファイルのパスが表示されています。sequence file numberが1となっていますが、これはこのテキストフィールドに入力されたファイルパスの1番(すなわちBcep_AMMD_03.seq)を示しています。レプリコンの大きい順ではありません。

「find canditates」ボタンを押して表示された結果を表計算シートに貼り付けました。同定されたユニークな11 baseに続いて各種の情報が表示されています。

テンプレーツに対して相同性検索した結果を出力することもできます。右側のprimer Aのテキストフィールドにprimer配列を入力して「blast primers」ボタンを押します。ここでは上の図の10行目のprimer候補について調べてみます(blastnのチェック結果として0(NG)が表示されています)。確かに2ndヒットで1 3　baseのアラインメントができてしまっています。これぐらいならOKでしょうか？

 

実行例 2

PCR用に2つのprimerをデザインしたら、2つのprimerがprimer dimerを作り得るかどうかを調べることができます。画面右側の2つのテキストボックスに2つのprimer配列を入力して「find primer dimer」ボタンを押してください。primer Aとprimer A、primer Aとprimer B、primer Bとprimer Bがprimer dimerをつくりうるかを判定できます。ギャップは考慮されません。

注意とヒント

Tm値の計算方法は2つの方法から選択できます。1つはCurrent Protocols in Molecular Biology記載の方法、もう一つはNearest Neighbor法です。

ここで実行されるblastnはblastallのblastnです。blastnのパラメーターを指定することができます。

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